本发明涉及一种不同类型环境样品中三唑磷农药的检测方法,包括以下步骤:(1)配置三唑磷标准溶液,进行高效液相色谱检测,采用外标峰面积法定量测定标准溶液的浓度,以色谱峰面积对三唑磷浓度做线性回归曲线;(2)对不同类型环境样品进行前处理,前处理包括三唑磷的提取和固相萃取;(3)对步骤(2)处理后的样品进行高效液相色谱检测,并结合步骤(1)所得的线性回归曲线,得到样品中三唑磷的浓度。与现有技术相比,本发明具有操作方便、准确、稳定可靠、回收率高、前处理过程中有机溶剂使用较少、对环境的二次污染少等优点。
1.一种不同类型环境样品中三唑磷农药的检测方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:(1)配置三唑磷标准溶液,进行高效液相色谱检测,采用外标峰面积法定量测定标准溶液的浓度,以色谱峰面积对三唑磷浓度做线性回归曲线;(2)对不同类型环境样品进行前处理,前处理包括三唑磷的提取和固相萃取;(3)对步骤(2)处理后的样品进行高效液相色谱检测,并结合步骤(1)所得的线性回归曲线,得到样品中三唑磷的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种不同类型环境样品中三唑磷农药的检测方法,其特征在于,所述的不同类型环境样品包括人工湿地水样、植物样品及人工湿地基质样品;对于水样的前处理方法如下:水样过0.45μm的滤膜,过滤水样连续通过SPE柱,流速控制为3-5mL/min;待水样全部通过后,用超纯水冲洗SPE柱内壁,然后用平稳的气流继续抽吸10分钟;最后用洗脱剂分两次洗脱,收集洗脱液作为液相色谱的供试液;对植物样品的前处理方法如下:取人工湿地植物样品,纯水洗净,根、茎、叶分别冷冻干燥后均匀粉碎,加提取溶剂,并超声破碎,静置,倾出上清液;再加入提取溶剂,超声破碎,过滤,滤液合并之前倾出的上清液并旋蒸近干,然后取萃取液萃取定容;最后将萃取液过SPE柱,并用洗脱剂分两次洗脱,收集洗脱液作为液相色谱的供试液;对人工湿地基质样品的前处理方法如下:取人工湿地3处以上的基质陶粒混合,自然风干后,去掉杂质,将陶粒粉碎,过100目筛,加提取溶剂后在恒温振荡器中振荡,并超声破碎,静置,倾出上清液;再加提取溶剂,超声破碎,过滤,滤液合并之前倾出的上清液并旋蒸近干,然后取萃取液萃取定容;最后将萃取液过SPE柱,并用洗脱剂分两次洗脱,收集洗脱液作为液相色谱的供试液。
3.根据权利要求2所述的一种不同类型环境样品中三唑磷农药的检测方法,其特征在于,所述的洗脱剂选自甲醇、乙酸乙酯、丙酮或乙腈;所述的提取溶剂选自乙腈、乙酸乙酯或二氯甲烷;所述的萃取液为甲醇。
4.根据权利要求3所述的一种不同类型环境样品中三唑磷农药的检测方法,其特征在于,所述的洗脱剂为乙腈,所述的提取溶剂为二氯甲烷。
5.根据权利要求2所述的一种不同类型环境样品中三唑磷农药的检测方法,其特征在于,所述的SPE柱使用前进行活化,具体方法为:使用前将5mL乙酸乙酯和5mL甲醇依次缓慢地通过SPE柱,洗脱掉干扰杂质,然后用10mL超纯水分2次淋洗SPE柱。
6.根据权利要求2所述的一种不同类型环境样品中三唑磷农药的检测方法,其特征在于,按以下比例配比进行加料:所述的水样取样200ml,所述的人工湿地植物样品粉碎后取样0.50g,所述的陶粒粉碎过筛后取样5.0g,所述的提取溶剂的总量为50ml,每次加入25ml,所述的萃取液加入5ml,所述的洗脱剂的量为5ml。
7.根据权利要求1所述的一种不同类型环境样品中三唑磷农药的检测方法,其特征在于,步骤(1)及步骤(3)中进行高效液相色谱检测的条件如下:色谱柱:内径250mm×4.6mm,不锈钢色谱柱,内填充Alltechxa0Apolloxa0C185um填料;流动相:甲醇与水的混合物,其中,甲醇与水的体积比为80:20;流速:2.0mL/mim柱温:30°C;检测波长:246nm;进样晕:10μL。技术领域
本发明涉及一种农药残留量的检测方法,尤其是涉及一种不同类型环境样品中三唑磷农药的检测方法。
背景技术
随着人们对环境保护和自身健康的日益关注,部分高毒高残留有机磷农药先后被禁用,三唑磷作为我国农业部推荐的中低毒农药,已经开始广泛应用于农业生产中。三唑磷(Triazophos,TAP),是20世纪70年代德国Hoechst公司开发的一种高效、中毒、广谱有机磷杀虫杀螨剂,它对农业害虫(螨)具有触杀、胃毒作用,兼具一定的内渗作用,适用于防治水稻、棉花、玉米、豆类、蔬菜中的虫害,另外水产养殖中也采用三唑磷杀菌和消除敌害。在我国由于三唑磷农药大量生产和长期使用,部分地区水体、土壤、植物中的残留量同样超过国家安全标准,对环境、生物及人体健康构成严重威胁。因此,建立高效准确的环境介质中三唑磷农药残留的分析方法,具有重大意义。针对三唑磷残留检测,刘曙照等曾发明三唑磷直接竞争酶联免疫吸附法用于农产品中和环境中三唑磷残留的快速检测。免疫分析法具有特异性强、灵敏度高、方便快速、分析容量大、分析成本低、安全可靠等优点。但足免疫分析法也存在一定局限性,如:变异系数大,需要一次性装膜的柱,抗体和酶标的半抗原使用量大,一次只能检测一个样品;开发过程需要投入较多的资金和时间,获取优质抗原较难,对试剂的选择性高,很难同时分析多种成分,对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应等。仪器分析法是农药残留检测中最经典、最常用的技术之一,具有灵敏度高、准确度好等优点。目前农药残留的仪器分析过程为提取-净化-检测。由于环境介质中三唑磷残留量低以及提取物组分过于复杂,样品中三唑磷需要经过提取、富集和净化等前处理过程才能进行检测。与传统的液-液萃取相比,固相萃取技术具有操作简便快速、有机溶剂用量少、能有效去除杂质、对目标物回收率高等优点。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种不同类型环境样品中三唑磷农药的检测方法。本发明针对投加三唑磷农药的人工湿地中的水样、植物样品和基质样品,采用固相萃取(SPE)前处理技术,通过优化操作条件,显著提高了人工湿地三种主要环境些介质中三唑磷的回收率。由于高效液相色谱法较气相色谱法具有高分离、高灵敏度等优点,本发明采用高效液相色谱法(HPLC)检测经过预处理样品中的三唑磷农药残留。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:一种不同类型环境样品中三唑磷农药的检测方法,该方法包括以下步骤:(1)配置三唑磷标准溶液,进行高效液相色谱检测,采用外标峰面积法定量测定标准溶液的浓度,以色谱峰面积对三唑磷浓度做线性回归曲线;(2)对不同类型环境样品进行前处理,前处理包括三唑磷的提取和固相萃取;(3)对步骤(2)处理后的样品进行高效液相色谱检测,并结合步骤(1)所得的线性回归曲线,得到样品中三唑磷的浓度。所述的不同类型环境样品包括人工湿地水样、植物样品及人工湿地基质样品;对于水样的前处理方法如下:水样过0.45μm的滤膜,过滤水样连续通过SPE柱,流速通过调节萃取装置的真空度来控制为3-5mL/min;待水样全部通过后,用超纯水冲洗SPE柱内壁,然后用平稳的气流继续抽吸10分钟;最后用洗脱剂分两次洗脱,收集洗脱液作为液相色谱的供试液;对植物样品的前处理方法如下:取人工湿地植物样品,纯水洗净,根、茎、叶分别冷冻干燥后均匀粉碎,加提取溶剂,并超声破碎,静置,倾出上清液;再加入提取溶剂,超声破碎,过滤,滤液合并之前倾出的上清液并旋蒸近干,然后取萃取液萃取定容;最后将萃取液过SPE柱,并用洗脱剂分两次洗脱,收集洗脱液作为液相色谱的供试液;对人工湿地基质样品的前处理方法如下:取人工湿地3处以上的基质陶粒混合,自然风干后,去掉杂质,将陶粒粉碎,过100目筛,加提取溶剂后在恒温振荡器中振荡,并超声破碎,静置,倾出上清液;再加提取溶剂,超声破碎,过滤,滤液合并之前倾出的上清液并旋蒸近干,然后取萃取液萃取定容;最后将萃取液过SPE柱,并用洗脱剂分两次洗脱,收集洗脱液作为液相色谱的供试液。进一步地,所述的洗脱剂选自甲醇、乙酸乙酯、丙酮或乙腈;所述的提取溶剂选自乙腈、乙酸乙酯或二氯甲烷;所述的萃取液为甲醇。更进一步地,所述的洗脱剂为乙腈,所述的提取溶剂为二氯甲烷。所述的SPE柱使用前进行活化,具体方法为:使用前将5mL乙酸乙酯和5mL甲醇依次缓慢地通过SPE柱,洗脱掉干扰杂质,然后用10mL超纯水分2次淋洗SPE柱。按以下比例配比进行加料:所述的水样取样200ml,所述的人工湿地植物样品粉碎后取样0.50g,所述的陶粒粉碎过筛后取样5.0g,所述的提取溶剂的总量为50ml,每次加入25ml,所述的萃取液加入5ml,所述的洗脱剂的量为5ml。步骤(1)及步骤(3)中进行高效液相色谱检测的条件如下:色谱柱:内径250mm×4.6mm,不锈钢色谱柱,内填充AlltechApolloxa0C185um填料;流动相:甲醇与水的混合物,其中,甲醇与水的体积比为80:20;流速:1.0mL/min;柱温:30xa0°C;检测波长:246nm;进样量:10μL。步骤(1)中配置的三唑磷标准溶液的浓度分别为0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L及8mg/L。与现有技术相比,本发明采用固相萃取-高效液相色谱法,经固相萃取后,样品中的三唑磷在色谱柱上分离良好,非目标分析物能够被有效洗涤去除,目标分析物得到高度纯化。高效液相方法操作简单,检出限可达1.7μg/L。本发明方法加标实际样品检测显示水样、人工湿地植物样品(美人蕉)、陶粒的平均加标回收率分别为95.7%±4.7%,88.8%±8.1%,86.5%±7.2%,可推广应用到其他环境介质中三唑磷农药残留的检测。同时,本发明具有操作方便、准确、稳定可靠、回收率高、前处理过程中有机溶剂使用较少、对环境的二次污染少等优点。
附图说明
图1为三唑磷标准样品的色谱图;图2为环境介质中三唑磷农药通过乙酸乙酯洗脱色谱图;图3为环境介质中三唑磷农药通过乙腈洗脱色谱图;图4为洗脱剂体积对三唑磷回收率影响图;图5为过SPE柱水样体积对三唑磷回收率影响图;图6为三唑磷标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例中所使用的仪器、试剂及样品如下:仪器Agilent1200型高效液相色谱仪(安捷伦科技公司,美国),具有二极管阵列检测;250mmxa0x4.6mm(i,d)不锈钢色谱柱,内填充AlltechApolloxa0C185um填料;KQ-200VDV型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);SHB-IIIA循环水式多用真空泵(上海豫康科教仪器设备有限公司);RE-3000A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司);恒温振荡器(上海一恒科学仪器有限公司);德国CHRIST冷冻干燥机(北京博劢行仪器有限公司上海分公司);美国Supelco12管防交互污染固相萃取装置及人容量采样管,GM-0.33A无油隔膜真空泵,CNWBONDxa0LC-C18SPE小柱(上海安谱科学仪器有限公司)。试剂与药品三唑磷标准样品纯度≥98.5%;85%的三唑磷乳油(上海强生化学试剂有限公司提供);超纯水;甲醇为色谱纯,乙酸乙酯、丙酮、乙腈、二氯甲烷为分析纯(上海国药试剂提供)。三唑磷标准样品的色谱图如图1所示。标准溶液配置准确称取0.0508g三唑磷(98.5%)标准品于100mL容量瓶中用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。配制浓度为50mg/L的储备液,分别精密移取适量储备液,用甲醇逐级稀释成浓度为0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/1、8mg/L的三唑磷标准溶液。样品制备四套水平潜流人工湿地小试装置位于同济大学实验温室,进水三唑磷农药(为0、0.1、1、5mg/L,水力负荷为100mm/d。人工湿地植物为美人蕉(Cannaxa0indica)(种植密度为20株/m²)、湿地填料为3-5mm粒径的陶粒。水样:人工湿地出水区取500mL水样,水样经过0.45μm的滤膜,收集滤液储于冷藏室中备用。植物样品:取人工湿地前、中、后端的美人蕉各一株纯水洗净,根、茎、叶分别冷冻干燥后均匀粉碎,储于冷藏室中备用。基质样品:取人工湿地植物根区陶粒500g置于通风橱中自然风干,去掉根系等杂质,将陶粒粉碎,过100目筛,储于冷藏室中备用。样品前处理水样:取200mL水样连续通过SPE小柱,流速通过调节萃取装置的真空度来控制为3-5mL/min;待水样全部通过后,用5mL超纯水冲洗SPE小柱内壁,然后用平稳的气流继续抽吸10分钟;最后用5mL乙腈分两次洗脱,收集洗脱液作为液相色谱的供试液。植物样品:取制备好的美人蕉0.5000g(精确至0.0002g)置于150mL的三角瓶中,加25mL二氯甲烷,超声破碎20min,静置,倾出上清液;再加入25mL二氯甲烷,超声破碎20min,过滤,滤液合并前倾出上清液旋蒸近干,然后取5mL甲醇萃取定容;最后将萃取液过SPE柱,并用5mL乙腈分两次洗脱,收集洗脱液作为液相色谱的供试液。基质样品:取制备好的陶粒5.00g(精确至0.02g)置于150mL的三角瓶中,加25mL二氯甲烷恒温振荡器中振荡30min,后续处理过程同美人蕉样品。实施例1一、确定操作工艺参数1、提取溶剂的选择用于植物和基质中有机磷农残的萃取溶剂主要有乙腈、乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷等。丙酮与水混溶,不易分离。本发明对比分析了乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷对美人蕉中三唑磷农药残留的萃取率(见表1)。结果表明,二氯甲烷的萃取率显著高于乙腈和乙酸乙酯,萃取率为90.7%,标准偏差为7.3%,因此选择二氯甲烷作为优选萃取剂。表1提取溶剂对三唑磷提取率的影响ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>2、SPE柱活化使用前将5xa0mL乙酸乙酯和5mL甲醇依次缓慢地通过SPE柱,以湿润、活化、平衡填料,洗脱掉干扰杂质,,然后用10xa0mL超纯水分2次淋洗小柱。3、洗脱剂选择洗脱剂是影响分析物SPE洗脱行为的重要因素。本实施例分析甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙腈等四种不同极性洗脱剂对三唑磷SPE回收率的影响,得出回收率相对较高的洗脱剂为乙酸乙酯(95.6%-101.3%)和乙腈(93.2%-97.5%)。但结合色谱图,乙酸乙酯洗脱色谱图上洗脱剂在目标物前出峰,且峰面积很人掩盖了目标物的峰(图2);乙腈洗脱色谱图中(图3),洗脱剂在目标物后出峰,对目标物分离过程和峰谱未产生干扰。因此本发明样品处理选择乙腈为优选洗脱剂。4、洗脱剂体积选择洗脱剂体积对三唑磷检测回收率的影响见图4。当洗脱剂的体积小于5xa0mL时,回收率随洗脱剂体积的增加明显提高;而当洗脱剂的体积大于5xa0mL到10xa0mL时,回收率随着洗脱剂体积的增加基本没多大变化。因此本发明样品处理选择洗脱液体积为5xa0mL,且分两次洗脱,进而获得较高的回收率。5、过SPE柱水样体积选择环境水体中三唑磷农药残留很低,液相峰谱很小甚至没有,不易检测,需要很高的富集倍数才能检测出来。为了适用于环境介质中三唑磷分析,需要选择合适的处理体积。以投加三唑磷运行的人工湿地进出水为水样,100mL为起始体积,每增加50xa0mL处理一次,测定回收率,直到250xa0mL,过柱水样体积对三唑磷回收率影响如图5所示。结果表明,过柱体积为200xa0mL时平均回收率最高,为97.5%。因此,为了获得较大的富集倍数,本发明选择过柱水样体积为200xa0mL。6、色谱条件选择流动相,甲醇+超纯水=80+20(V+V);流量1.0xa0mL/min;柱温30°C;检测波长246nm;进样量10uL。二、对样品进行测定1、三唑磷的标准曲线配置浓度为0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/1、8mg/L的三唑磷标准溶液,在上述色谱条件下,采用外标峰面积法定量测定。以色谱峰面积(X)对三唑磷浓度(Y)做线性回归曲线,如图6所示。线性回归方程为Y=0.04381*X-0.03008(R²=0.9999)。根据外推法计算该方法的检出限为1.7μg/L。2、仪器及方法稳定性本发明采用上述优化选择的前处理方法对含三唑磷农药残留的水样品含量重复测定5次(见表2),结果表明,该方法检测符合国家农药残留痕量分析要求。表2仪器稳定性试验结果ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>3、回收率实验对水样、美人蕉和陶粒等样品进行加标回收检测试验,计算3次结果的平均回收率,列于表3、表4、表5。结果表明水样平均加标回收率为95.7%(±4.7%)、美人蕉平均加标回收率为88.8%(±8.1%)、陶粒平均加标回收率为86.5%(±7.2%)。表3水样回收试验结果(n=3)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表4美人蕉样品回收试验结果(n=3)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表5陶粒样品回收试验结果(n=3)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>4、样品测定取三唑磷投加浓度为0.1mg/L的人工湿地的出水水样、美人蕉及陶粒样品,进行高效液相色谱检测,并结合线性回归曲线,结果显示出水水样中三唑磷浓度为6μg/L;美人蕉根茎叶中三唑磷平均含量为0.12mg/kg;陶粒中三唑磷量0.114mg/kg。实施例2一种不同类型环境样品中三唑磷农药的检测方法,该方法包括以下步骤:(1)配置浓度分别为0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L及8mg/L的三唑磷标准溶液,进行高效液相色谱检测,采用外标峰面积法定量测定标准溶液的浓度,以色谱峰面积对三唑磷浓度做线性回归曲线,如图6所示,线性回归方程为Y=0.04381*X-0.03008(R²=0.9999)。(2)对不同类型环境样品进行前处理,前处理包括三唑磷的提取和固相萃取:对于水样的前处理方法如下:水样过0.45μm的滤膜,过滤水样连续通过SPE柱,SPE柱使用前进行活化,具体方法为:使用前将5mL乙酸乙酯和5mL甲醇依次缓慢地通过SPE柱,洗脱掉干扰杂质,然后用10mL超纯水分2次淋洗SPE柱。流速通过调节萃取装置的真空度来控制为3-5mL/min;待水样全部通过后,用超纯水冲洗SPE柱内壁,然后用平稳的气流继续抽吸10分钟;最后用洗脱剂(本实施例中为乙腈)分两次洗脱,收集洗脱液作为液相色谱的供试液;对植物样品的前处理方法如下:取人工湿地植物样品(美人蕉三株),纯水洗净,根、茎、叶分别冷冻干燥后均匀粉碎,加提取溶剂(本实施例中为二氯甲烷),并超声破碎,静置,倾出上清液:再加入提取溶剂,超声破碎,过滤,滤液合并之前倾出的上清液并旋蒸近干,然后取萃取液萃取定容;最后将萃取液(本实施例中为甲醇)过SPE柱,并用洗脱剂分两次洗脱,收集洗脱液作为液相色谱的供试液;对人工湿地基质样品的前处理方法如下:取人工湿地3处以上的基质陶粒混合,自然风干后,去掉根系等杂质,将陶粒粉碎,过100目筛,加提取溶剂后在恒温振荡器中振荡,并超声破碎,静置,倾出上清液;再加提取溶剂,超声破碎,过滤,滤液合并之前倾出的上清液并旋蒸近干,然后取萃取液萃取定容;最后将萃取液过SPE柱,并用洗脱剂分两次洗脱,收集洗脱液作为液相色谱的供试液。各物质的加料比例关系为:水样取样200ml,人工湿地植物样品粉碎后取样0.50g,陶粒粉碎过筛后取样5.0g,提取溶剂的总量为50ml,每次加入25ml,萃取液加入5ml,洗脱剂的量为5ml。(3)对步骤(2)处理后的样品进行高效液相色谱检测,并结合步骤(1)所得的线性回归曲线,得到样品中三唑磷的浓度。步骤(1)及步骤(3)中进行高效液相色谱检测的条件如下:色谱柱:内径250mm×4.6mm,不锈钢色谱柱,内填充AlltechApolloxa0C185um填料;流动相:甲醇与水的混合物,其中,甲醇与水的体积比为80:20;流速:1.0mL/min;柱温:30xa0°C;检测波长:246nm;进样量:10μL。